В том же году в составе Калининской области в качестве пограничного округа был образован Великолукский округ — вдоль западной границы СССР с Латвией. 11 мая 1937 года из части районов Великолукского округа образован Опочецкий округ, а позже эти два округа и Карельский округ были упразднены. На начало 1941 года в состав Калининской области входили уже 69 районов. На 1939 год в Калининской области проживали 2487,2 тыс. человек.

Боевые действия на территории Калининской области начались уже через десять дней после нападения гитлеровцев на СССР. 5 июля враг захватил город Себеж (ныне территория Псковской области).

В первые три месяца войны на фронт были призваны более 200 тысяч жителей Калининской области, десятки тысяч ушли добровольцами. Те, кто не смог попасть на фронт, создавали отряды народного ополчения и истребительные батальоны, строили оборонительные рубежи. Так, в строительстве оборонительного рубежа на линии Осташков — Селижарово — Молодой Туд — Ржев длинной в 240 км участвовали около 150 тыс. человек, которые работали днём и ночью, невзирая на бомбардировки.

Несмотря на героическое сопротивление Красной Армии, уже к середине октября 1941 нацистами были оккупированы 38 из 69 районов области. 11 октября были заняты Зубцов и Погорелое Городище, 12 октября — Старица, 14 октября враги вошли в Ржев и в Калинин.

17 октября был создан Калининский фронт, в состав которого вошли 22-я, 29-я, 30-я и 31-я армии, возглавил фронт генерал-полковник Иван Конев. Соединения Калининского фронта должны были очистить от врага район Калинина и пресечь попытки гитлеровцев обойти Москву с северного направления. Однако враг имел значительное — в разы — превосходство и в технике, и в людях. В ноябре фашисты начали наступление, прорвали оборону и вышли к Волге в районе Завидово, захватили Клин и продолжили движение в направлении столицы. Соединения Калининского фронта несли огромные потери — более 50 тыс. убитыми и ранеными. Несмотря на превосходство противника, Красная Армия сумела в ходе оборонительных боёв уничтожить около 35 тыс. вражеских солдат и офицеров.

Калининская наступательная операция началась 5 декабря 1941 года. 16 декабря Красная Армия очистила от немцев Калинин — он стал первым областным центром, освобождённым от врага с начала Великой Отечественной войны.

Начало 1942 года ознаменовалось новыми победами советских войск — была освобождена Старица, войска вышли к Ржеву и Зубцову. В рамках Ржевско-Вяземской наступательной операции (8 января — 20 апреля 1942 г.) нацисты были отброшены на 80—250 км к западу. С 9 января началась Торопецко-Холмская операция — от захватчиков были освобождены Андреаполь и Торопец. Однако окончательно Калининская область была очищена от нацистов лишь в 19 июля 1944 года.

Самыми тяжёлыми и кровопролитными боями на территории Калининской области стали бои за Ржев, которые шли больше года, город освободили только в марте 1943 года. Потери Красной Армии в Ржевской битве составили около миллиона человек.

Небольшой город с населением в 56 тысяч человек находился в оккупации 17 месяцев. Из 20 тыс. населения, которые не успели покинуть город до прихода нацистов, выжили только 150 человек. Во всём Ржевском районе выжили после оккупации только 297 советских граждан.
Сам город был фактически стёрт с лица земли — были разрушены все промышленные предприятия, учреждения, около 95% жилого фонда.

С момента оккупации и до полного освобождения Калининской области на её территории действовало в общей сложности 23 партизанских отряда, а также около сотни партизанских групп, в них участвовали около 14 тыс. партизан. На их счету уничтожение около 700 эшелонов с военной техникой и продовольствием для врагов, около трёх тысяч автомашин, 111 складов с боеприпасами и продовольствием, 38 танков. Партизанские отряды уничтожили десятки тысяч оккупантов. Более 5 тыс. калининских партизан награждены орденами и медалями.

Посмертно присвоено звание Героя Советского Союза Елизавете Чайкиной и Николаю Горячеву. 23-летняя Елизавета Чайкина была секретарём Пеновского подпольного райкома комсомола Калининской области и стала организатором партизанского отряда. Нацисты схватили Чайкину 22 ноября 1941 году на хуторе Красное Покатище — о том, что в одном из домов находится комсомолка, оккупантам донёс староста. Семью подруги Чайкиной, в доме которой девушку нашли немцы, расстреляли. Саму Лизу Чайкину долго пытали, чтобы получить информацию о местонахождении партизан. Елизавета Чайкина не сдалась под пытками, и была расстреляна 23 ноября 1941 года. Николай Горячев ушёл в партизанский отряд в 17 лет, в 1941 году. Погиб в бою с немцами в апреле 1943 года: попав в окружение и не желая сдаваться в плен, взорвал гранату. Похоронен в братской могиле.